Pérez Llano B, García Casado P1, Sala Echave R, Enciso M2, Gosálvez J2
Gestión Veterinaria Porcina S.L.Pol.Ind.P-29 C/Calibre 121 28400 C.Villalba, Madrid, Spain
1Dpto. Reproducción Animal, INIA, Ctra.Coruña km.5.9, 28040 Madrid, Spain
2Unidad de Genética, Facultad de Biología, Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid, Spain
INTRODUCCIÓN
La evaluación de la calidad seminal incluye varias pruebas que evalúan diferentes características espermáticas como la motilidad, la vitalidad, la morfología, el estado del acrosoma, la funcionalidad de la membrana plasmática. La integridad del ADN espermático es un factor muy importante que debe ser tenido en cuenta en la evaluación de semen porque está relacionado con los resultados de fertilidad y el normal desarrollo del embrión (1, 3, 4), pero hasta ahora, esta prueba no había sido incluida en la evaluación rutinaria del semen.
Se han utilizado varias técnicas para valorar la integridad del ADN espermático. Recientemente, una nueva técnica, Sperm Chromatin dispersion (SCD) Test, ha sido desarrollada para semen humano y adaptada para semen de verraco (SPERM-Sus-HALOMAX®). Este método proporciona imágenes de los espermas tratados con un núcleo central y un halo periférico formado por los bucles de ADN dispersados a su alrededor. El grado de fragmentación del ADN puede ser determinado por el tamaño del halo (nucleos con baja fragmentación no producen halos o estos son muy pequeños en la cabeza del espermatozoide, mientras que aquellos núcleos con altos niveles de fragmentación del ADN liberan los bucles de ADN formando grandes halos)(2). El objeto de este trabajo es el estudio de varios parámetros de calidad seminal como, motilidad, estado del acrosoma, integridad de la membrana plasmática (HOSTc) y el nivel de fragmentación del ADN en semen de verraco puro y diluído en ACROMAX ® (GVP, Madrid, Spain), un diluyente de larga duración, utilizando el nuevo SCD Test SPERM-Sus-HALOMAX® (ChromaCell SL, Madrid, Spain)
MATERIAL Y MÉTODOS
Se realizó una sola recogida de semen de siete verracos adultos de entre 18-24 meses de edad. La calidad seminal se valoró mediante el porcentaje de motilidad, porcentaje de acrosomas normales (Pursel and Johnson 1974), porcentaje de formas anormales, porcentaje de células positivas al HOSTc (Pérez-Llano et al.1998) y porcentaje de fragmentación del AND espermático. Todas las pruebas se realizaron en muestras de semen puro y diuído el mismo día de la recogida (día 1).
De cada ejaculado se tomaron 2 muestras: una muestra de 20 ml se guardó en un recipiente de plástico sin diluyente y otra muestra de 2 ml fue diluída en 18 ml de ACROMAX® (GVP, SL, Madrid, Spain). Después de un período de equilibración de 3 horas a temperatura ambiente, ambas muestras de cada eyaculado se guardaron a 15ºC durante 21 días. Durante el período de conservación, se tomaron muestras los días 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 16 and 22 para valorar los parámetros de calidad mencionados.
Para determinar el nivel de fragmentación de ADN (DFI, DNA Fragmentation Index) en los espermatozoides de verraco, se utilizó el kit Sperm-Sus-Halomax® (ChromaCell SL, Madrid, Spain) (Figure 1a,b). El método se basa en la inclusión de las células espermáticas en un microgel de agarosa extendido en un portaobjetos, un proceso de lisis y tinción para microscopio óptico. El porcentaje de espermatozoides que desarrollan un gran halo de dispersión de cromatina alrededor de la cabeza es calculado contando 200 células en un microscopio óptico (X400). Para asegurar que bajo cualquier condición experimental la producción de un gran halo de dispersión de cromatina estaba relacionado con la presencia de AND fragmentado, se realizó la prueba In Situ Nick Translation (ISNT) los días 4, 11 and 22.
Figura 1a. Espermatozoides de verraco procesados con la técnica Sperm Sus Halomax® y teñidos para microscopio óptico (a) o in situ nick translation (b). En ambos casos, las células espermáticas con grandes halos de dispersión de cromatina se corresponden con cabezas espermáticas que contienen ADN fragmentado mientras que aquellas sin halo o con halos mínimos contienen ADN no fragmentado.
Figura 1b. Detalle
de cabezas de esperma de verraco conteniendo ADN fragmentado y no
fragmentado